压电材料因其独特的电-机械转换特性，在神经科学研究中受到了广泛关注。特别是在神经细胞的方向性生长调控方面，压电材料能够提供非侵入式的电刺激，促进神经损伤修复。然而，目前的天然压电生物材料，如丝素蛋白，普遍缺少周期性压电畴结构，导致其电场分布不均匀，难以精准引导神经突的生长方向。此外，传统压电聚合物的电场分布难以可视化，使得研究人员无法实时观察其对神经细胞的影响。
为了解决这一问题，我校先进纤维材料全国重点实验室、材料科学与工程学院张耀鹏、范苏娜团队以光化学策略成功在丝素薄膜中构建可视化的周期性压电结构。通过在丝素薄膜内原位合成银纳米颗粒形成了微米级可区分的周期性压电畴结构。这些银纳米颗粒充当显影剂，并调控丝素薄膜的压电电荷（d33）和电压（g33）系数。通过压电力、静电力和调幅开尔文探针力显微镜（PFM，EFM和AM-KPFM）证实周期性压电畴的存在和周期性电场分布。在超声刺激下，丝素压电器件的最大均方根电流、能量密度和电压分别达到5.1mA、6.7Wm−2和529.5 mV。证实了所构建的周期性压电结构能够显著调控PC12细胞的神经突的生长方向、长度和基因表达，并通过显微镜实时观察到电场对神经突生长的影响。该研究以《可见的周期性压电畴丝素膜引导神经突生长》（Visible Periodic Piezoelectric Domains in Silk Fibroin for Neurite-Orientated Extension）为题在线发表于《先进材料》（Advanced Materials）上。论文第一作者为东华大学博士生陈杰。
可见的周期性压电畴丝素膜
硝酸银溶液浸泡后的丝素薄膜在光掩模的遮挡下经LED光照后，在其表面和内部形成显影图案，从而制备出图案化丝素薄膜。这种方法能够在丝素薄膜中制备出微米级图案（图1）。研究者采用X射线光电子能谱表征了图案化薄膜的组成和分布，并通过透射电子显微镜证实银纳米颗粒（晶格间距为2.0和2.3Å）分布于图案区域中，以上结果证实了本研究中的图案化区域是一种丝素/银纳米颗粒复合物。
图1 通过光化学方法制造的图案丝素薄膜。a）使用光化学策略在丝素膜上制造周期性压电畴图案，并通过超声驱动刺激PC12细胞分化。b，c）图案化薄膜的光学显微镜图像（b）和XPS Mapping图像（c）。d）从图案丝素膜中提取的银纳米颗粒的TEM图像。
周期性压电畴
薄膜中有图案区和无图案区表现出显著的压电差异（图2）。图案丝素膜表面具有明显的枝晶形貌。振幅和相位反馈与表面形态不同，显示明显的明暗交替，其中图案区的颜色更亮。这表明图案区与无图案区存在相反方向的畴结构。压电系数与丝素材料结构密切相关。利用微聚焦同步辐射X射线衍射研究图案区和无图案区的结晶度。图案区在18.96°处显示出银纳米颗粒的结晶峰（d间距：2.35，Q：2.67），对应于（111）晶格平面，并且与无图案区相比有更高的结晶度（60%），表明形成了更多的非中心对称晶体（主要是β折叠形式）。银纳米颗粒的原位合成过程中促进了丝素二级结构的运动和丝素晶粒尺寸畸变，有效地调控了图案丝素薄膜的凝聚态结构，导致压电系数的增强。
图2 丝素薄膜中图案区和无图案区之间的电学和结构特性的差异。a）PFM图像的图案丝素薄膜的形貌、面外振幅和相位。b）图案区中的压电响应曲线。红线拟合曲线表示d33的平均值。c）图案区和无图案区之间的平均d33差异。d）显影时间对实部介电常数的影响。e，f）无图案区（e）和图案区（f）的1D SR-WAXD衍射图。g）图案区和无图案区之间的结晶度和晶粒尺寸差异。
超声驱动的丝素压电膜的电学输出
超声是在液体中驱动压电发电机器件的一种方便高效的工具。将丝素或丝素/银纳米颗粒薄膜制成压电发电机器件并浸入自制的水下测试设备中，以评估其在水中的电学输出特性（图3）。该设备经0.6 Wcm−2声强，1 MHz驱动频率下，电压、电流和功率最大均方根达到529.5 mV、5.1 mA和2.7 mW，其中功率密度为6.7 Wm−2。与其他工作相比，该工作具有更高的电流输出（Irms）和功率密度的优势，满足了细胞生物学中对细胞的电刺激要求。
图3 丝素/银纳米颗粒薄膜在水中超声驱动下的压电输出。a，b）不同显影时间下薄膜的电压（a）和电流（b）输出。c，d）距离（c）和超声强度（d）对丝素/银纳米颗粒薄膜压电输的影响。
神经突在周期性压电畴上的定向生长和基因表达
尽管银纳米颗粒已获准用于医疗器械，但仍必须仔细评估全曝光丝素/银纳米颗粒薄膜对PC12的生物毒性（图4）。与丝素薄膜上的PC12相比，丝素/银纳米颗粒薄膜上的PC12的活力降低。然而，第5天在丝素/银纳米颗粒薄膜上的PC12活力相比于第1天的结果，仍增加了588%。因此，图案丝素薄膜可用于随后的PC12分化实验。随后，使用1 MHz超声驱动具有10 μm间隔的图案丝素薄膜，刺激PC12分化。凭借丝素良好的光学透明性，PC12在显微镜下清晰可见，接种4小时后在薄膜上呈圆形。第五天后，与丝素膜相比，PC12的神经突在图案丝素膜的垂直方向上延伸。
为了观察神经突在图案丝素膜上的生长情况（图5），对β-微管蛋白（Tuj1）和微管相关蛋白2（MAP2）分别进行了免疫荧光染色。不论是否利用超声驱动压电膜，PC12的神经突在图案丝素膜表面培养时，倾向于在图案垂直方向上延伸。相比之下，PC12的神经突在常规丝素膜上并未发生定向的延伸。这表明周期性压电畴改善了神经突的生长方向。PC12的神经突长度统计表明，未施加超声刺激时，与常规丝素膜相比（107.5 ± 40.7 μm），图案丝素膜上的神经突长度增加到110.0 ± 40.1 μm。在超声刺激下，与常规丝素膜相比（113.2 ± 40.7 μm），图案丝素膜上的神经突长度进一步增加到120.5 ± 50.0 μm。此外，与无超声刺激的常规丝素膜相比，无超声刺激的图案丝素膜上关于Tuj1和GFAP的基因表达增加了1.46和2.17倍，存在显著差异。在超声刺激下，图案丝素膜上关于Tuj1和GFAP的基因分别增加了1.66和17.53倍。上述结果表明，超声驱动的图案丝素膜诱导了神经突的生长方向，加速了神经突的生长，促进了神经元突触形成和相关基因的表达，促进了星形胶质细胞的成熟。
图4 PC12细胞活力和分化。a）CCK-8测试PC12细胞在丝素和丝素/银纳米颗粒膜上的活力（n = 5，p* < 0.05）。b）超声驱动图案丝素膜刺激PC12分化示意图。c）受超声和图案影响的PC12神经突在图案丝素膜上的光学图像。（c）中的白色箭头表示神经突。“–”：无超声刺激的细胞培养;“+”：超声刺激培养。比例尺：100 μm。
图5 图案丝素薄膜刺激的PC12细胞分化。a）在PC12细胞中表达的特异性神经蛋白。b）PC12的神经突的方向统计。c）PC12的神经突长度统计。d，e）PC12的特定神经蛋白的mRNA表达。“–”：无超声刺激的细胞培养;“+”：超声刺激培养。比例尺：50 μm。“ns”：不显著。
本研究不仅解决了天然压电生物材料缺乏周期性电场分布的问题，还成功实现了电场分布的可视化，为研究非侵入式电刺激对细胞行为的影响提供了全新工具。更重要的是，该方法具有高效、可规模化生产的特点，为细胞生物学方面的应用提供了新的可能。未来，该技术有望在神经损伤修复、电刺激治疗及生物电子器件等领域发挥重要作用，为精准电刺激治疗开辟新路径。
